Co-inoculación de bacterias durante la fermentación alcohólica: una práctica reconocida

 Publicado el Por Sibylle Krieger-Weber (Lallemand) , Eveline Bartowsky (Lallemand) , José María Heras (Lallemand) , Magali Déléris-Bou (Lallemand)

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La fermentación maloláctica (FML) se da en el vino como resultado de la actividad metabólica de las bacterias acido lácticas del vino (BAL) con la descarboxilación enzimática del ácido L-málico en ácido L- láctico y dióxido de carbono. La FML en el vino reduce su acidez, permite una mejor estabilidad e influye en sus perfiles sensoriales, todo ello considerado beneficioso para calidad del vino. La FML puede ocurrir durante o después de la fermentación alcohólica y se lleva a cabo por una o más especies de BAL. Se identificaron cepas de cuatro géneros como los principales organismos implicados en la FML: Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus y Pediococcus (Du Toit et al., 2011). No todas las BAL indígenas son eficientes y algunas de ellas pueden producir ciertos aromas desagradables que tienen un impacto negativo en la calidad de vino. Oenococcus oeni es la especie predominante y la mejor adaptada para lograr la FML, sobre todo bajo condiciones difíciles del vino, y con un efecto positivo en su perfil sensorial.

La tendencia a reducir o evitar adiciones de SO2 y el aumento del pH en los mostos, debido al calentamiento global, aumentan el riesgo de un crecimiento excesivo de bacterias no deseables, lo que puede dañar la calidad del vino. Entre los distintos aromas no deseados que pueden aparecer con la FML descontrolada, es bien sabido que algunas bacterias ácido lácticas enológicas espontáneas pueden producir aminas biógenas (sobre todo histamina, putrescina y cadaverina) que no solo pueden ser nocivas para la salud humana sino que también impactan negativamente en el perfil sensorial del vino enmascarando los aroma varietales. Se sabe también que algunas bacterias enológicas específicas (O. oeni y L. plantarum) tienen también la capacidad de degradar los ésteres de ácidos hidroxicinámicos, dando como resultado un incremento de las correspondientes formas libres en el vino, p. ej. ácido cumárico, que son precursores de la producción de fenoles volátiles por Brettanomyces.

Por lo tanto, la selección de bacterias enológicas adecuadas es crucial para el desarrollo y la estabilidad del vino, tanto desde el punto de vista de la calidad (reducción de defectos), sensorial (estilo de vino) así como desde el punto de vista económico (salida al mercado más temprana).

La importancia de la inoculación con una bacteria enológica bien caracterizada

Se ha seleccionado y caracterizado una gama completa de bacterias Oenococcus oeni fiables para asegurar una FML rápida y completa bajo diferentes condiciones del vino. El uso de bacterias seleccionadas tales como VP41™, Alpha™, Beta™ o Silka™, entre otras, dan como resultado un mejor control de la degradación del ácido L-málico y garantizan que no se produzcan aminas biógenas ni precursores de etil fenoles. Cada bacteria enológica también está bien caracterizada por su impacto sensorial. Hay estudios que demuestran que los compuestos aromáticos producidos por las BAL enológicas generan cambios apreciables en las características aromáticas de un vino y otros que muestran como las distintas BAL enológicas producirán diferentes efectos sensoriales en los mismos. Por ejemplo, en general, VP41™ contribuirá a producir vinos afrutados, Beta™ se verá reflejado en vinos frescos y Alpha™ dará redondez a los vinos. Al mismo tiempo, el momento en que se realiza la inoculación de la bacteria y la población celular del vino tras la inoculación influirán también en el perfil sensorial (Abrahamse y Bartowsky, 2012).

Más recientemente, se ha seleccionado una nueva generación de Lactobacillus plantarum para dar una solución a las consecuencias del calentamiento global, siendo capaz de llevar a cabo una FML muy rápida y segura, cuando se inocula al día siguiente de la levadura (co-inoculación) en la elaboración de vino tinto con alto pH. L. plantarum utiliza una ruta homofermentativa para el metabolismo del azúcar y por eso no produce ácido acético cuando se desarrolla en el mosto de uva. L. plantarum ML Prime™ ha sido bien caracterizada para realizar la función de la FML, por su impacto sensorial y por no producir aminas biógenas ni precursores de fenoles volátiles.

Diferentes momentos de inoculación

Tradicionalmente, cuando se utilizan las bacterias enológicas seleccionadas, la inoculación se realiza cuando termina la fermentación alcohólica (FA). Desde 1980, los investigadores han estudiado la posibilidad de inocular BAL enológicas en el mosto junto con la levadura o poco después de la inoculación de la levadura al principio de la fermentación alcohólica

Hoy en día, hemos identificado dos momentos diferentes de inoculación de las BAL enológicas a lo largo del proceso de vinificación (Figura 1).

Co-inoculación con levaduras:

- Bacterias ácido lácticas enológicas seleccionadas añadidas entre las 24 a 48 horas después de la inoculación de levadura (48 a 72 horas si se añade de 80 a 100 ppm de SO2 al estrujado). Esta práctica está ganando mucha popularidad debido a sus diversos beneficios.

Fermentación post-alcohólica:

- Bacterias ácido lácticas enológicas seleccionadas añadidas al final o justo después de terminar la FA.

Beneficios de la co-inoculación con bacterias enológicas seleccionadas

Gestión del tiempo del proceso y seguridad:

La inoculación entre las 24 a las 48 horas posteriores a la adición de la levadura garantiza que las bacterias seleccionadas encuentren los nutrientes claves necesarios en el mosto de uva y que se puedan adaptar lentamente al contenido creciente de alcohol durante la fermentación alcohólica. Esta técnica asegura mayores índices de supervivencia y de vitalidad de las bacterias inoculadas, dando como resultado una mejor implantación y un predominio temprano de la FML. Esto les permite no solo superar a la flora de las BAL indígenas, tales como las especies Lactobacillus heterofermentativas, Pediococcus, sino también limitar el desarrollo de Brettanomyces.

Al aplicar estrategias de co-inoculación, los vinos inoculados con nuestras bacterias seleccionadas no contendrán aminas biógenas tales como la histamina o la tiramina, algo que puede ocurrir con frecuencia durante la FML espontánea o la FML retrasada tras la finalización de la fermentación alcohólica.

Por último, la finalización de la FML es más rápida comparada con la inoculación secuencial, lo que permite que el vino se estabilice antes, evitando posibles contaminaciones microbianas (Figura 2). Los vinos estables y limpios están listos para salir antes al mercado, comparados con los vinos producidos con FML secuencial o espontánea.

Herramientas de biocontrol sobre el desarrollo y contaminación del vino por Brettanomyces:

Se ha demostrado que algunas bacterias enológicas (O. oeni y L. plantarum) tienen la capacidad de degradar los ésteres de ácidos hidroxicinámicos presentes en el vino y liberar sus formas libres, que son los precursores de la producción de fenoles volátiles por las levaduras Brettanomyces (Osborne et al. 2012). Los fenoles volátiles producidos por Brettanomyces transfieren al vino aromas desagradables descritos como “establo”, fenolados o medicinales. Este estudio puso de relieve que algunas bacterias enológicas O. oeni tienen claramente la capacidad de incrementar el nivel de ácido cumárico (forma libre) en el vino. Si hay Brettanomyces en el vino, metabolizará el ácido cumárico dando como resultado un aumento del nivel de etil fenoles y el consiguiente deterioro del vino (Figura 3).

Sus resultados demostraron que en función de la bacteria enológica seleccionada para inducir la FML, se podían detectar distintas concentraciones de ácidos cinámicos libres. Así pues, al usar una bacteria enológica seleccionada, debería ser cinamil esterasa negativa para evitar la producción de precursores de fenoles volátiles por Brettanomyces. Todas nuestras bacterias acido lácticas seleccionadas han sido probadas y se ha confirmado que todas ellas son cinamil esterasa negativa como de muestra en la Figura 4.

Diversos estudios del IFV (Instituto Francés de la Viña y del Vino, Francia) han demostrado que la co-inoculación con bacterias enológicas seleccionadas reducirá el tiempo de latencia entre la fermentación alcohólica y fermentación maloláctica y, en consecuencia, el desarrollo de Brettanomyces durante este periodo sensible, cuando el vino está desprotegido.

En este estudio se monitorizaron las poblaciones de levaduras y de bacterias en un vino contaminado con Brettanomyces e inoculado para la FML con bacterias seleccionadas (Figura 5) y en una FML espontánea (bacterias indígenas) (Figura 6) para demostrar cómo las bacterias ácido lácticas pueden afectar al desarrollo de Brettanomyces. Cuando se inocularon con bacterias enológicas seleccionadas, no hubo crecimiento de Brettanomyces (incluso con una contaminación alta) y además, la población de Brettanomyces disminuyó a medida que aumentaba la población de bacterias seleccionadas. Por el contrario, con la FML espontánea, la población de Brettanomyces mantiene el nivel alto de contaminación hasta el decimoprimer día (fecha del trasiego) y después del trasiego se observó un repunte Brettanomyces debido al lento desarrollo de la población de bacterias espontáneas. Los niveles finales de Brettanomyces son significativamente diferentes entre los vinos con co-inoculación y los vinos control: los vinos control tienen 10 veces más células Brettanomyces que los co-inoculados. Estos resultados confirman la fuerte competencia entre nuestras bacterias seleccionadas y las Brettanomyces, debido al temprano predominio y la excelente viabilidad de estas bacterias. El interés de aplicar la co-inoculación para controlar el crecimiento de Brettanomyces ha sido reconocido por la OIV como parte de sus buenas prácticas de elaboración (OIV Oeno-264-2014).

Impacto sensorial del momento de inoculación de las bacterias ácido lácticas seleccionadas:

El momento de la inoculación, la interacción con la levadura enológica, la presencia de precursores que promueven la producción de los compuestos aromáticos, el pH y las condiciones de temperatura son todos criterios que modulan la expresión aromática de los vinos. La elección de la bacteria y del momento en que se inocula se han convertido en un factor clave a tener en cuenta para desarrollar un perfil específico del vino.

El uso de la co-inoculación da lugar a diferentes perfiles aromáticos del vino comparado con la inoculación secuencial con las mismas bacterias; los vinos se suelen percibir como más afrutados, mejor equilibrados y con más cuerpo, comparados con los vinos inoculados al final de la fermentación alcohólica, cosa que no siempre ocurre durante la inoculación secuencial (Figura 7). Tras la finalización de la FML, los vinos jóvenes se muestran como mejor integrados y armoniosos.

La co-inoculación de levaduras seleccionadas y BAL enológicas tiene también una implicación estilística en lo que a la producción de diacetilo se refiere. Nuestros estudios han demostrado que la co-inoculación a menudo da como resultado vinos de un estilo más afrutado al contrario que el láctico, de mantequilla o nuez que se produce cuando la FML comienza al terminar la fermentación alcohólica (inoculación secuencial). Por el contrario, la co-inoculación limitará la producción de diacetilo y si este se produce, se reducirá en presencia de levaduras a 2,3-butanodiol, que tiene un umbral aromático mucho más alto. Como consecuencia, el carácter afrutado de los vinos blancos y rosados se verá reforzado con una estrategia de FML con co-inoculación (Figura 8).

Gestión de la acidez volátil:

A pesar del metabolismo heterofermentativo de Oenococcus oeni y del teórico riesgo de la producción de acidez volátil en presencia de azúcares, numerosos experimentos (Semon et al., 2001; Rosi et al., 2003; Jussier et al., 2006) y muchos años de experiencia práctica en bodega han demostrado que no se produce una cantidad significativa de ácido acético a partir de azúcares durante el crecimiento de las BAL enológicas seleccionadas y la FML activa. No se han encontrado diferencias reveladoras en los niveles de acidez volátil en los vinos procedentes de co-inoculación comparados con los de la inoculación secuencial. Más recientemente, un estudio llevado a cabo por Zapparoli et al., (2009) en matrices de vino con alto alcohol demostraron que, en las variedades Corvina y Rondinella utilizadas para la producción de vino Amarone, los niveles de ácido acético eran similares, o incluso más bajos cuando se recurría a la co-inoculación en comparación con la inoculación secuencial. Determinadas condiciones bien conocidas (buena gestión de la fermentación alcohólica: elección de una cepa de levadura fiable, buen control de temperatura y una estrategia de nutrición adaptada) son esenciales para asegurar un nivel bajo de ácido acético en el vino final.

Consideración del coste

La práctica de la co-inoculación significa una FML más corta, fiable y completa. Esto reduce significativamente la necesidad de calentar depósitos o la bodega, paso necesario para iniciar la FML cuando se busca una inoculación secuencial o espontánea.

En el marco del proyecto de investigación consorciado VinySost (“Nuevas estrategias vitivinícolas para la gestión sostenible de la producción en grandes superficies y el incremento de la competitividad de las bodegas en el mercado Internacional”), llevado a cabo en España, realizamos un estudio que consistía en fermentaciones malolácticas controladas utilizando la co-inoculación con Lalvin VP41™ en comparación con la fermentación espontánea. Mantuvimos los vinos a 20°C hasta que se completó la FML. La Figura 9 resume la experimentación. La FML con co-inoculación fue muy rápida (completada 5 días después del final de la FA), mientras que el depósito de fermentación espontánea la empezó muy tarde (completada 45 días después del final de la FA). En este largo periodo de tiempo, el consumo de energía para calentar el depósito fue significativo, del orden de 150 kWh/hL.

Este gasto de energía para el ensayo de la FML espontánea tenía un coste calculado del orden de 10 €/hL (el coste puede variar dependiendo del precio por kWH según el país, la potencia del equipo de calefacción, la temperatura exterior, el volumen del vino y la duración de la FML). Entre otros estudios realizados para varios años, este nuevo resultado confirma que el coste de energía es mucho más alto que el coste de la inoculación con las bacterias enológicas seleccionadas. Al mismo tiempo, además de este gasto de energía, también se ha ahorrado muchos otros costes directos tales como la monitorización analítica del vino y otros costes ocultos por la posible menor calidad del vino. Se ha demostrado que la inoculación con nuestras bacterias ofrece garantías de calidad en los vinos acabados: biocontrol contra el desarrollo de Brettanomyces u otras bacterias ácido lácticas indeseables, sin riesgo de producción de aminas biógenas, además de ayudar al vino a retener su estilo sensorial.

Un nuevo concepto de Lactobacillus plantarum seleccionada para la co-inoculación en mostos tintos con pH alto

A pesar de los resultados infalibles que demuestran que no hay un incremento importante de la AV durante la co-inoculación con O. oeni, hay todavía algunos enólogos que consideran arriesgada la co-inoculación con Oenococcus oeni debido a sus propiedades heterofermentativas obligatorias. Temen, equivocadamente la co-inoculación, aunque esta práctica ha probado suficientemente ser una elección segura también para tintos con pH alto (por encima de 3,5-3,6) en los que la flora nativa es más que crítica.

En la vinificación de uvas de mayor madurez, que dan como resultado mostos con mayor pH, el uso de una nueva generación de cultivo iniciador de BAL enológica seleccionada consistente en Lactobacillus plantarum ofrece varias ventajas: L. plantarum tiene un metabolismo homofermentativo, lo que significa que no produce ácido acético a partir de azúcares hexosa. Unas pocas especies de Lactobacillus pueden comportarse muy eficientemente bajo condiciones del vino y poseen muchas características que favorecen la FML, especialmente en un medio con pH alto, como se ha demostrado en la solicitud de patente (EP1631657). La selección de una “buena” Lactobacillus plantarum enológica no es fácil. Aislada en la Universidad Católica del Sacro Cuore de Italia, nuestra bacteria ML prime™ ha demostrado ser una L. plantarum muy efectiva. Garantiza una FML rápida y segura, de 3 a 7 días para completarse, dependiendo de las condiciones. Debido a un proceso de producción específico y optimizado, ML Prime™ manifiesta una actividad enzimática maloláctica muy alta, dando como resultado una rápida FML durante la fermentación alcohólica junto con otras propiedades enológicas interesantes. ML Prime™ es una alternativa efectiva e inigualable para la co-inoculación, además de ultrarrápida, pensada para una FML sin riesgos, incluso en mostos sulfitados con normalidad (Figura 10).

Conclusión

La co-inoculación es la práctica que consiste en inocular bacterias enológicas seleccionadas al comienzo del proceso de elaboración del vino poco después de la inoculación de la levadura. Esta técnica ha ganado popularidad no solo porque asegura una fermentación maloláctica completa y rápida, sino porque tiene también muchas otras ventajas reconocidas por los enólogos y los profesionales del vino. En Francia y España, por ejemplo, cerca del 50% de FML ahora se lleva a cabo mediante co-inoculación. La co-inoculación desempeña un papel fundamental a la hora de garantizar un proceso de FML más rápido y seguro y una estabilización del vino más temprana, junto con un ahorro de coste y de energía. Limita el desarrollo de microorganismos contaminantes con lo que reduce la producción de compuestos de aromas no deseados, asegurando la calidad del vino.

Referencias

CDTI (Programa CIEN) “Nuevas estrategias vitivinícolas para la sostenibilidad y el incremento de la competitividad del sector en el mercado internacional (VINySOST 2014).

Abrahamse, C., and E. Bartowsky. 2012a. Timing of malolactic fermentation inoculation in Shiraz grape must and wine: influence on chemical composition. World J Microbiol Biotechnol. 28: 255-265.

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Du Toit, M., L. Engelbrecht, E. Lerm, and S. Krieger-Weber. 2011. Lactobacillus: the next generation of malolactic fermentation starter cultures – an Overview. Food Bioprocess Technol. 4:876-906.

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Swiegers JH, Bartowsky EJ, Henschke PA, and I. Pretorius. 2005. Yeast and bacterial modulation of wine aroma and flavour. Austral J Grape Wine Res. 11:139–173

Zapparoli G., Tosi E., Azzolini M., Vagnoli P., and S. Krieger S. 2009. Bacterial inoculation strategies for the achievement of malolactic fermentation in high-alcohol wines. S Afr J Enol Vitic.; 30:49–55.

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