Importancia de la microbiología del ambiente de las bodegas de vino

 Publicado el Por Antonio Tomás Palacios

Tópico(s): Enología

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La atmósfera de las bodegas puede albergar microorganismos que causen alteraciones en la calidad del vino e incluso representar un riesgo para la salud de los consumidores. Controlar su crecimiento y actividad es esencial para obtener un producto de calidad y acorde a las exigencias de seguridad alimentaria.

Hoy en día se reconoce que las levaduras y bacterias que intervienen en los procesos de fermentación disponen de tres fuentes posibles: uvas, material de bodega (Fleet y Heard, 1993) y microorganismos seleccionados comerciales. Las uvas tienen una importante población de microbios adheridos a la pruina, constituidos por levaduras, bacterias y mohos, pero el equipo de bodega (despalilladora, estrujadora, tuberías, cubas, etc.), los trabajadores e insectos también contribuyen y, por lo tanto, a medida que el mosto entra en contacto con los diferentes equipos, dicha microbiota pasa al medio fermentativo donde pueden crecer y multiplicarse. También representan parte de la flora aérea Aspergillus, Botrytis y Penicillium, mohos que aparecen con frecuencia, siendo en parte productores de tricloroanisol (TCA) y causantes del gusto a “moho” y Ocratoxina A (OTA).

La presencia de mohos y otros microorganismos en el aire de una bodega de vinificación y crianza depende de muchos factores, como época del año, punto de muestreo y actividad que se lleva a cabo en la bodega. Las fluctuaciones de temperatura, humedad relativa y el diseño de la bodega son factores determinantes. Las zonas con poca ventilación favorecen altos niveles de humedad y, por ende, una mayor presencia de moho en el aire. La población de moho en estas áreas no es muy diversa, lo que indica que la colonización por ciertos tipos de mohos bien adaptados a las condiciones puede ser permanente. Áreas con mayor flujo de aire, actividad constante y limpieza frecuente, muestran poblaciones de moho más bajas y mayor biodiversidad.

El gusto de “moho” ha sido identificado como un serio defecto en el vino embotellado. La microflora desarrollada en forma de micelios en los corchos de botellas, además de destruirlo, puede contribuir al desarrollo del defecto mediante la degradación de clorofenoles utilizados en la desinfección de lugares de trabajo, pallets y otros equipos, transformándolos en cloroanisoles, responsables del defecto.

Sobre la presencia de Brettanomyces en la atmósfera de bodegas no hay mucha literatura, sin embargo en sidra, si se ha encontrado (Beech; 1993). Está demostrado que durante la fermentación alcohólica y maloláctica, los microorganismos que se encuentran en las cubas son liberados a la atmósfera y, a partir de ahí, pueden contaminar cubas vecinas. El aire en sí no permite que se desarrollen microbios y solo actúa como medio de soporte portador, estando adheridos a partícula de polvo, gotas de agua o como única partícula hasta que los microorganismos llegan a su destino (Curiel, Van Eijk y Lelieveld; 2000). De hecho, las levaduras Rhodotorula y Sporobolomyces spp pueden ser una causa de contaminación y son géneros descritos como levaduras marcadoras de higiene insuficiente, (Davenport; 1996).

En estudios realizados en la Universidad de La Rioja publicados por Ana Rosa Gutierrez, se encontraron levaduras en el aire con diferentes valores dependiendo de la actividad de la bodega. La población en el área de embotellado aumenta cuando se está realizando el llenado, lo que requiere en esta zona mayor vigilancia. También aumenta Saccharomyces cerevisiae en el aire en las instalaciones de vinificación durante los procesos fermentativos, siendo las no Saccharomyces las que dominan el resto del año, como Aureobasidium y Cryptococcus, aunque estas no representan un riesgo real para la calidad del vino. Brettanomyces se detectó en el aire presente en la sala de barricas, lo que sugiere que el aire puede ser un medio para que estas células de levadura contaminantes se propaguen en las bodegas.

En estos mismos trabajos también se encontraron bacterias lácticas aisladas en el aire de la bodega perteneciendo a las especies Pediococcus pentosaceus y Oenococcus oeni, siendo ambas responsables de la fermentación maloláctica, aunque la primera puede suponer un riesgo de alteraciones, siendo el aire un factor en la propagación de estos microorganismos principalmente en el momento en que el líquido se trasiega.

Dada la importancia de la microbiología presente en la atmósfera de bodega, se recomienda para caracterizar y cuantificar este ecosistema aéreo realizar muestreos utilizando bombas de vacío que soportan medios de cultivos específicos. Se llaman aerobiocolectores y toman un volumen determinado de aire conduciendo a los microorganismos presentes hacia las placas Petri con medios de cultivo selectivo, que posteriormente se incuban en las condiciones idóneas dependiendo del microorganismo investigado.

Sistema de muestreo microbiológico a partir de atmósfera

Los muestreos que se presentan en este trabajo se realizaron mediante el sistema Microkit Bioaerosol Sampler (MBS), siendo este un equipo para muestreos de aire por impacto sobre medios de cultivos sólidos, empleándose placas Petri de 55 mm para evitar reflujos.

Los bioaerosoles son partículas del aire sean sólidas o líquidas que contienen microorganismos vivos. Pueden variar en tamaño, desde fracciones de micra hasta más de 100. Igual que las partículas inertes de polvo, los bioaerosoles están gobernados por las leyes de la gravedad, pero afectados y transportados por los movimientos del aire y sus turbulencias. Por ello el método de sedimentación pasiva no es válido y no aporta información cuantitativa fiable. La bomba empleada consiste en un impactador que recolecta bacterias y hongos del aire a un flujo estándar de 100 litros/minuto a través de una serie de poros de 1 mm de diámetro, y las estrella sobre un agar preparado en placas de contacto. Los medios agarizados utilizados pueden ser elegidos según los microorganismos deseados (bacterias, hongos, patógenos, microalgas...). Tras el muestreo las placas se incuban adecuadamente y se cuentan posteriormente las colonias desarrolladas.. Así se obtiene el número de ufc/m3. Se suelen tomar 5 placas a partir de 200 L de aire de cada sala, la suma de las 5 dará directamente el número de ufc presentes en 1 m3. Se aplica un factor de corrección (NMP: número más probable) para tener en cuenta que varios microorganismos pueden atravesar un mismo poro y formar una sola colonia.

Los microorganismos que encontramos en el aire tienen grandes dificultades de supervivencia: los rayos UV y las inclemencias del tiempo crean un ambiente hostil con poco alimento (y a veces poca humedad). Sin embargo suelen agregarse en partículas y entre sí (microcolonias) que aumentan su resistencia. Además algunas especies producen pigmentos para protegerse del efecto UV, por eso en algunos aislados encontramos colonias pigmentadas de rojo (levaduras Rhodotorula): Las células pueden resistir largos períodos de tiempo en latencia, provocando alteraciones en los productos fabricados.

Casos prácticos de bodegas

Bodega embotelladora de vinos dulces:

Es una bodega que embotella vinos blancos dulces y de repente empezó a observar sedimentos en el fondo de las botellas, posos escasos que desaparecían con la agitación y volvían a reaparecer al cabo de unos días. El sedimento estaba formado por levaduras contaminantes que no realizaban fermentación alguna, solo producían biomasa formando sedimento al cabo de una semana después del embotellado.

Los muestreos se realizaron según el método arriba descrito empleando medios de cultivo selectivo de levaduras en base agar-malta. La toma de muestras se realizó siguiendo el circuito natural de las botellas en la línea de embotellado, tal y como se puede observar en la Figura 3. Según este gráfico, los puntos de mayor contaminación por parte de levaduras y aerobios totales es en el interior de la embotelladora en la zona de llenado, justo después de la zona de lavado de botellas, donde se acumulaban las levaduras contaminantes para después diseminarse a otras zonas.

Se identificaron mediante PCR tres tipos diferentes de colonias: una blanca, otra roja y la última marrón. La primera de ellas presenta tamaños de fragmentos ITS que se corresponden con la especie Zigosacharomyces Bailii. Esta levadura es especialmente resistente a condiciones de estrés y es común entre las especies de levaduras contaminantes responsables de defectos organolépticos en el vino, sobre todo causando refermentaciones en vinos con azúcares residuales (ver Figura 4).

Las otras dos colonias muestran fragmentos ITS que permiten identificarlas a nivel de género, pero no de especie. Se trata de levaduras Rhodotorula y Pichia. La primera fue encontrada en la colonia de color rojizo y se trata de una levadura pigmentada. Es un organismo de hábitat común en el medio ambiente, su metabolismo es capaz de capturar compuestos nitrogenados en el aire, lo que hace que sea de fácil crecimiento en ambientes cargados. La levadura del género Pichia, identificada en la colonia de color marrón, es una levadura perteneciente a la familia Saccharomycetaceae. Este género es común entre las especies de levaduras contaminantes en el proceso de vinificación, pudiendo ser potencialmente responsable de defectos organolépticos, formando biofilms en los puntos de contaminación donde reside (ver Figura 4).

Parece que la contaminación detectada en las botellas de vino de la bodega está relacionada con restos de azúcares, ya que las tres especies identificadas se desarrollan bien en este medio. Los azúcares se pueden acumular en estructuras de difícil limpieza, sobre todo por caramelización con el empleo de agua caliente en los circuitos de limpieza. Se aconsejó para este caso la esterilización del ambiente mediante aplicación de ozono y también tratamientos químicos a nivel de los circuitos internos de la línea de embotellado.

Bodega contaminada por anisoles:

En un primer análisis de los vinos de alta gama se pudo verificar los siguientes valores de anisoles en 12 vinos (ver Tabla 1). De estos resultados se puede deducir que en la mayoría de los vinos no existe una identificación clara por cata de la presencia de problemas de anisoles, sino de pérdida de afrutado y apagados en cata, excepto en aquellas muestras donde coexisten el TCA y TBA superando claramente los umbrales de detección sensorial. Lo más llamativo es la presencia constante de TBA en todas las muestras, lo que puede indicar una contaminación ambiental de la bodega.

Como conclusión de este estudio inicial, se deduce que los vinos presentan una contaminación basal de 2,5 nanog/l de TBA, con un nivel cercano al umbral de percepción de 3 nanog/l. Los vinos defectuosos en cata tienen niveles superiores a los 3 ng/l dada la suma del TCA y TBA. Por lo tanto, la contaminación principal no proviene del corcho, sino de una contaminación acumulativa en el vino, probablemente durante varias etapas de su elaboración. Algunos corchos están también contaminados y aumentan la percepción del defecto. El diagnóstico principal del problema es la contaminación de la bodega. Por este motivo, se realizó un análisis ambiental en la búsqueda de los contaminantes y sus precursores.

Como se puede observar en la Tabla 2 existe una seria contaminación del ambiente de la bodega, tanto a nivel de precursores (TBP) como de anisoles bromados (TBA), principalmente en los ambientes no ventilados, como son la sala subterránea de barricas y el botellero. Lo que procede entonces es identificar las fuentes de la contaminación para poder aislarlas del vino y posteriormente eliminarlas lo antes posible.

Para ello se realiza un estudio exhaustivo de los materiales de construcción presentes en las zonas contaminadas y de los utensilios de vinificación y crianza del vino, como se puede observar en la Tabla 3.

Podemos ver como los precursores (TBP) están presentes principalmente en la estructura de madera en el techo de la sala de barricas subterránea, en los paneles aislantes del botellero y en los bins de madera, siendo en estos ambientes donde hay mayores cantidades de TBA. Estos elementos están entonces actuando como fuentes de contaminación principal. El contaminante del tipo TCA solo se encuentra en corchos. El TeCA y el PCA se encuentran también en los bins de madera para guardar las botellas.

Es llamativo que la contaminación por TBA está muy extendida en todos los materiales, lo que indica que los controles preventivos son muy importantes, ya que si la contaminación no se detecta de forma prematura, los costes de eliminación de los contaminantes van a ser mucho mayores. A la vista de estos resultados se puede concluir que el lugar principal de contaminación está ubicado en la sala de barricas subterránea. La sala de guarda de botellas, aunque tiene un nivel de contaminación ambiental muy alto por la presencia de numerosas fuentes, no presenta mayor riesgo de contaminación del vino embotellado. Sin embargo, se debe manejar esta sala con ventilación.

Estudiando el área de bodega que resultó más contaminada, la mayor acumulación de precursores (ver Tabla 3) se encuentra en los paneles que revisten los techos y las estructuras de madera. Por lo que las investigaciones se centran en estos elementos, como se puede verificar en la Tabla 4. Se investiga además en algunas estructuras a que profundidad se encuentran los contaminantes con la idea de verificar los tipos de tratamientos curativos a realizar y su intensidad, por si es necesario raspar o eliminar totalmente las estructuras donde se encuentran los contaminantes.

Una vez identificados los focos y los puntos de contaminación medioambiental, fruto de la existencia de materiales con precursores y el desarrollo de moho en el ambiente de bodega, se realiza un plan de saneamiento acorde a las circunstancias para poder o bien aislar las estructuras contaminadas o proceder a su eliminación, además de poner las medidas necesarias para evitar las condiciones atmosféricas que permiten el crecimiento de los mohos.

Referencias bibliográficas

Beech, F.W.; Yeasts in cider making. In The Yeasts, Yeast Technology, 2nd edn., Vol. 5 ed. Rose, A.H. and Harrison, J.S. pp. 66–96. London: Academic Press. 1993

Chatonnet, P., Bonnet, S., Boutou, S., and Labadie, D.L.; "Identification and responsibility of 2,4,6-tribromoanisole in musty, corked odors in wine" Journal Agricultural and Food Chemistry, 2004.

Curiel G.J., Van Eijk H.M.J., Lelieveld H.L.M.; Risk and control of airborne contamination. In: Encyclopedia of Food Microbiology. Robinson, R.K., Butt, C.A. and P.D. Patel (Eds.), Academic Press, 1816-1822. 2000.

Davenport, R.R.; Forensic microbiology for soft drinks business. Soft Drinks Manag. 34-35. 1996.

Rubio, P., Garijo, P., Santamaría, P., Lopez, R., Martínez, J., Gutierrez A.R.; Influence of oak origin and ageing conditions on wine spoilage by Brettanomyces yeasts. Food Control 54. 176-180. 2015.


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